Факторы, влияющие на эффективность лечения при фаговой терапии

Факторы, влияющие на эффективность лечения при фаговой терапии
3.5 балов от 4 оценок

В последние годы использование литических бактериофагов в качестве противомикробных агентов, контролирующих патогенные бактерии, появилось в качестве многообещающей новой альтернативной стратегии перед лицом растущей устойчивости к антибиотикам, что вызвало проблемы во многих областях, включая медицину, ветеринарию и аквакультуру. Использование бактериофагов имеет многочисленные преимущества по сравнению с традиционными противомикробными препаратами. 

Эффективность применения фагов в борьбе с патогенными бактериями зависит от нескольких факторов, таких как соотношение бактериофагов / бактерий-мишеней, режим и момент обработки, условия окружающей среды (pH, температура ...), нейтрализация фага и доступность для бактерий-мишеней. , среди других. В этом отчете представлены эти факторы и проблемы, связанные с разработкой приложений для фаговой терапии.

Бактериофаги (фаги) - это вирусы, которые заражают только бактерии. Они примерно в 50 раз меньше бактерий (20–200 нм) и повсеместно распространены в почве, воде и некоторых пищевых продуктах (мясо, овощи, молочные продукты. «Вирулентные» и «умеренные» фаги различаются по своему действию. Первым этапом заражения фагом является адсорбция частицы фага бактериальной клеточной стенкой посредством специфических взаимодействий между вирусными поверхностными белками и рецепторами клетки-хозяина. После проникновения в бактериальную клетку вирулентные фаги быстро реплицируются, синтезируя геном и структурные белки в вирионы потомства внутри клетки-хозяина. Наконец, новые фаги убегают, разрывая клеточную стенку, что приводит к гибели клетки. Напротив, умеренные фаги интегрируют свой генетический материал в хромосому клетки-хозяина, которая реплицируется вместе с геномом клетки-хозяина (профаг). Следовательно, они могут впоследствии появиться внутри новой клетки-хозяина. Только умеренные фаги, которые могут проникать в бактериальный геном, участвуют в горизонтальных переносах генов между бактериальными популяциями. Для антибактериальных применений используют вирулентные фаги, которые обладают способностью быстро лизировать бактериальные клетки.

Использование бактериофагов для лечения бактериальных инфекций изучалось до Второй мировой войны. Эти исследования не были продолжены после обнаружения антибиотиков. Но в последние годы, с появлением нескольких штаммов бактерий, резистентных к антибиотикам, исследования снова обратились к бактериофагам. Использование фагов для инактивации патогенных бактерий рассматривается как интересный способ замены антибиотиков в медицине человека. Действительно, бактериофаги считаются «интеллектуальными противомикробными препаратами» из-за специфики их действия. Они заражают бактерии-мишени без какого-либо влияния на комменсальную флору и естественным образом уничтожаются вместе с полным уничтожением патогенных бактерий.

В ветеринарной медицине были проведены многочисленные исследования по борьбе с бактериальными заболеваниями и борьбе с передачей людям патогенов, вызывающих болезни пищевого происхождения. Например, уменьшение загрязнения Campylobacter и другими патогенными бактериями фагами изучалось в нескольких публикациях. Птицеводство и медицина могут извлечь выгоду из этих результатов с точки зрения снижения экономических потерь и улучшения общего благосостояния потребителей.

Бактериофаги были изучены в агропродовольственной промышленности для выявления и контроля патогенных бактерий в пищевых продуктах. Преимущество использования литических фагов заключается в их высокой специфичности к патогенным бактериальным штаммам хозяина. Они не влияют на технологическую флору или комменсальную флору пищеварительного тракта. Кроме того, бактериофаги не вызывают аллергию у людей и не изменяют структуру, запах или вкус пищевых продуктов.

Исследования фагов были обширными в течение последнего десятилетия. Многие модели животных были доступны для надежных исследований. Исследования на фагах вышли за пределы лаборатории. Фаговые продукты были одобрены и коммерциализированы. Регулярно в США выдавались разрешения на коммерческие продукты фага. В 2006 году FDA (Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов) одобрило использование и приготовление бактериофагов, обычно признанных безопасными, в качестве пищевых добавок для борьбы с патогенной бактерией. monocytogenes в продуктах из мяса и птицы. В Европе использование Listex TM было также одобрено в Швейцарии для производства сыра и недавно было одобрено для других типов продуктов питания. ТМ Listex также был одобрен для использования в пищевой промышленности в соответствии с пищевыми стандартами Австралии и Новой Зеландии в 2012 году. В настоящее время несколько продуктов фагов производятся в промышленных масштабах:

Несмотря на это увеличение интереса к исследованиям и производству фаговых продуктов, применение в фаговой терапии не всегда было успешным. Эффективность применения фагов против патогенных бактерий зависит от нескольких факторов, таких как соотношение бактериофаг / бактерии, физико-химические факторы, нейтрализация фагов или устойчивость к фагам. Кроме того, данные в пробирке не могут быть непосредственно применены к в естественных условиях ситуации и не могут виво в данных для одного фага быть переданы другим фаг. Критическими параметрами, которые влияют на фаговую терапию, являются скорость адсорбции фага, размер всплеска, латентный период и начальная доза фага. Другим критическим параметром является скорость очистки частиц фагов от жидкостей организма ретикулоэндотелиальной системой или явлениями нейтрализующих фаг антител. Некоторые ключевые факторы представлены на рис  1.

Соотношение фагов / бактерий
Использование бактериофагов против патогенных бактерий изучалось с использованием двух разных подходов: один пассивный, другой активный. В случае пассивного подхода бактериофаги добавляются в систему на уровне, достаточном для обеспечения того, чтобы все бактерии-мишени были инфицированы и лизированы в течение короткого периода времени. Напротив, активный биоконтроль зависит от добавления небольшого количества фагов. Бактериальная элиминация в этом случае предполагает репликацию фагов в течение нескольких поколений. Способность новых реплицируемых фагов к доступу к целевым бактериям может быть ослаблена биохимическими и физико-химическими характеристиками системы (например, вязкостью). Похоже, что пассивное лечение более эффективно, чем активное.

В вирусологии соотношение бактериофагов / бактерий объясняется термином MOI (множественность инфекции), который относится к числу вирусов, которые добавляются на клетку во время инфекции. MOI используется только в жидкостных системах с большим количеством клеток-хозяев. В экспериментах in vitro и in vivo на фаге против бактерий обычно используют MOI от 0,01 до 100. Чаще всего МВД составляет 100, чтобы гарантировать, что в средствах массовой информации достаточно фагов. Однако не все фаги реплицируются или выживают одинаково. Важно определить репликацию литических циклов и устойчивость фагов к условиям окружающей среды.

Условия окружающей среды и устойчивость к фагам
На выживание и устойчивость бактериофагов влияют физико-химические факторы. Популяция фага в целом стабильна по отношению к внешним факторам. Некоторые фаги могут храниться в течение длительного периода при нейтральном pH (от 6 до 8) в растворе или в сухом виде. Титры фагов обычно медленно снижаются с рН. Например, титр фагов S. aureus снижался на 2 log между 4 и 6 часами, когда рН снижался с 6,19 до 5,38. Пролиферация нескольких фагов ограничена, когда pH ниже 4,5, но риск загрязнения пищевых продуктов патогенными бактериями также обычно снижается ниже pH 4,5. Например, фаг Т4 ( Myoviridaeсемейство) нестабильно при pH <5. Фаг PM2 ( семейство Corticoviridae ) полностью теряет активность через 1 ч при pH 5,0 при 37 ° C. Однако в случае пероральной инъекции фага желудочная кислота может оказывать негативное влияние на выживание фага, что может привести к неудаче лечения. Латентный период увеличивается, когда фаги инкубируют при температурах охлаждения. Бактериофаг может выживать при высоких температурах (40–90 ° C), а некоторые фаги Lactococcus могут выживать при пастеризации. При исследовании стабильности фага MS2 в различных солевых растворах авторы показали, что одновалентные соли не влияют на титр фагов. В соответствии сЛанглет и соавт. (2008) более высокая ионная сила может увеличить агрегацию фага.

Помимо этих условий окружающей среды, биохимический состав матрицы также влияет на доступность бактерий-мишеней.

Доступность для целевых бактерий
Диффузия бактериофагов может быть нарушена или улучшена в зависимости от структуры и состава матрицы и условий окружающей среды. В твердых средах диффузия бактериофагов может быть ограничена, что снижает адсорбцию фагов на бактериях и, следовательно, способность фаговой инфекции. Например, Guenther et al. (2009) показали, что использование бактериофагов ограничивалось их диффузией в твердых пищевых матрицах, таких как хот-доги, копченый лосось и морепродукты.

Наличие других соединений может защитить бактерии от фагов. Фаг К активен в отношении многочисленных штаммов S. aureus, но неактивен в сыром молоке, что ограничивает его применение при бычьем мастите. Предположительно, что иммунные факторы, присутствующие в сыром молоке, препятствовали фагам получить доступ к бактериям. Некоторые белки в сыворотке могут ингибировать адсорбцию фага на бактериях.

При фаговой терапии выход инвазивных патогенов в закрытые отсеки тканей и органов может блокировать эффективное использование бактериофагов, особенно если фаг не может активно следовать за бактериями. Также неясно, насколько эффективными будут фаги при лечении заболеваний, вызываемых внутриклеточными патогенами (например, видами сальмонелл ), когда бактерии размножаются преимущественно внутри клеток человека и недоступны для фагов.

В исследовании выявлено, что выживание бактерий в кишечнике во время пассажа фага может быть объяснено только некоторыми физиологическими причинами, которые предотвращали индуцированный фагом лизис. Аксенических мышей заражали одним штаммом E.coli, а затем им давали фаги в питьевой воде. Титры фагов в кале увеличились за один день с 10 5 / мл в питьевой воде до 10 10 / мл в кале, в то же время количество кишечной палочки в кале уменьшилось с 10 8 до 10 4 КОЕ / мл и стабилизируется при 10 5КОЕ / мл в последующие дни. Бактерии не были полностью лизированы в стуле, хотя эти бактерии чувствительны к фагам. Эти результаты свидетельствуют о том, что бактерии находились в кишечнике, защищенном от фага.

Фаги, в отличие от многих молекул антибиотиков, не проникают через мембраны и поэтому должны иметь способ доставки для достижения клеток-мишеней. Некоторые исследователи считают, что наилучший механизм доставки может заключаться в использовании других непатогенных видов бактерий для доставки фага к его патогенной мишени.

Циркуляция фага и нейтрализация фага антителами
Чтобы лучше понять доступность фага для бактерий, некоторые авторы изучили, как циркулируют фаги, но доступно немного публикаций на эту тему. Некоторые авторы предполагают, что фаги попадают в кровоток лабораторных животных (после однократного перорального приема) в течение 2-4 часов и обнаруживаются во внутренних органах (печени, селезенке, почках и т. Д.) Примерно через 10 часов. Кроме того, данные о стойкости вводимых фагов указывают на то, что фаги могут оставаться в организме человека в течение относительно длительного периода времени, то есть до нескольких дней.

В экспериментальной схеме, где мыши были инфицированы штаммом лизогена ϕMR11, защиты не наблюдалось, что позволило авторам заключить, что прямой бактерицидный эффект фага был основной детерминантой защитного эффекта, а не любого косвенного эффекта, такого как стимулируемый фагом иммунный ответ (например, производство цитокинов; Matsuzaki et al., 2003). Количество фагов и бактерий в кровотоке было определено после заражения и показало, что бактериальная нагрузка была намного ниже в крови мышей, обработанных фагом, по сравнению с теми, которые получали только бактерии. Они также заметили, что титры фагов у мышей, зараженных бактериями, оставались выше, чем титры у мышей, получавших только фаг. Это говорит о том, что фаг размножился у зараженных мышей и потреблял бактерии.

Хотя фаг может хорошо циркулировать в крови и в разных органах, но некоторые авторы предполагают, что фаги могут быть нейтрализованы антителами, которые снижают эффективность фагов для лизиса бактерий-мишеней. Геллер и соавт. (1998) показали, что добавление молозива в молоко, загрязненное фагом, предотвращает лизис стартовых культур L. lactis . Однако не ясно, как долго антитела будут оставаться в обращении. Согласно ( Сулаквелидзе и др., 2001), развитие нейтрализующих антител не должно быть существенным препятствием на начальном этапе лечения острых инфекций, поскольку кинетика действия фага намного быстрее, чем выработка нейтрализующими антителами хозяина. Более того, если нейтрализующие фаг антитела все еще присутствуют во время второго курса лечения или если быстрый анамнестический иммунный ответ возникает до того, как фаги оказывают свое действие, можно было бы предусмотреть повторное введение или увеличение концентрации фага. Другим решением для выживания нейтрализации фага антителами было бы использование различных фагов, потому что устойчивость отличается от одного фага к другому.

В 1996 разработан оригинальный метод для решения этой проблемы. Удалось выделить мутантов, чья стабильность в крови увеличилась, повторив следующую процедуру от восьми до десяти раз: (1) введение фагов в брюшную полость мыши, (2) восстановление фагов из крови 7–18 ч после инъекции (3) размножение восстановленных фагов in vitro и (4) повторное введение пролиферированных фагов мышам. Мутант, полученный из фагов после длительной циркуляции, имел модифицированный капсидный белок.

Защита фагов
Одним из решений для защиты бактериофага в месте заражения и во время поездки на этот участок является микрокапсуляция, которая определяется как технология упаковки твердых веществ, жидкостей или газообразных материалов в миниатюрные капсулы, которые могут высвобождать свое содержимое с контролируемой скоростью при определенных условия. Микрокапсулирование применяется для повышения жизнеспособности пробиотических бактерий во время обработки, а также для адресной доставки в желудочно-кишечный тракт. Микрокапсулирование вирусов было изучено как эффективная адъювантная система для индукции специфических иммунных реакций через слизистые пути. Сообщалось о разработке пероральных микроинкапсулированных форм для бактериофагов для лечения гастроинфекции у крупного рогатого скота. Эти авторы показали, что метод инкапсуляции позволяет большой части бактериофага оставаться биологически активным в моделируемой среде желудочно-кишечного тракта, что указывает на то, что эти микросферы могут облегчать доставку терапевтического фага в кишечник.

Доза и момент лечения
Другим важным фактором, который может изменить эффективность лечения фагом, является разовая доза против нескольких доз. Несколько исследований показали, что несколько доз лучше, чем разовая доза. Одно исследование Хаффа и соавт. (2003a , b) обнаружили, что лечение цыплят, страдающих тяжелыми респираторными инфекциями, вызванными кишечной палочкой, очень помогло в устранении симптомов. Применение бактериофага было наиболее полезным очень скоро после того, как цыплята подверглись воздействию бактерий, и что при раннем лечении многократные дозы были лучше, чем однократная. Интересно, что если лечение начинается позже, нет разницы между однократной или многократной дозой, но лечение все еще очень полезно ( Huff et al., 2003a , b ).

В очень тщательном исследовании Biswas et al. (2002) провели эксперименты на мышиной модели устойчивой к ванкомицину инфекции Enterococcus faecium . Сначала они показали, что фаг, вводимый внутрибрюшинно через 45 минут после заражения, способен спасти мышей от E. faecium и что это спасение связано со значительным снижением количества бактерий в крови. Они также продемонстрировали, что введение фагом до 5 ч после заражения все же полностью спасло мышей, в то время как лечение, отложенное на 5 ч, спасло только некоторых мышей ( Biswas et al., 2002 ).

Фаговая администрация
Одним из преимуществ использования фагов является простота введения. Фаги можно применять пероральным, локальным, внутрибрюшинным, внутривенным или интраназальным введением. Приготовление и производство фага может осуществляться в патогенной бактериальной культуре. В этом случае он должен контролировать токсин или остатки культуры бактерий, которые могут провоцировать воспалительный феномен ( Gill and Hyman, 2010 ).

Фаготерапия была использована для лечения различных бактериальных инфекций. Они могут использоваться в лиофилизированной форме и превращаться в таблетки без существенного влияния на эффективность. Температурная стабильность до 55 ° C и срок годности 14 месяцев были показаны для некоторых типов фагов в форме таблеток. Применение в жидкой форме также возможно, предпочтительно хранить в охлажденных флаконах.

Пероральное введение работает лучше, когда включен антацид, так как это увеличивает количество фагов, выживших при прохождении через желудок.

Местное применение часто включает нанесение на марли, которые укладывают на обрабатываемый участок.

В исследовании эффективности бактериофагов для лечения инфекций, вызванных Klebsiella ozaenae, K. rhinoscleromatis scleromatis и K. pneumonia ( Bogovazova et al., 1991 , 1992 ), сообщалось, что препарат фага эффективен при лечении экспериментальных инфекций мышей и морские свинки. Klebsiella поливалентный бактериофаг вводили внутрибрюшинно, внутривенно или интраназально на 2-й день после заражения животных клебсиеллами . Результат показал, что бактериофаг, введенный внутрибрюшинно, оказался эффективным при лечении генерализованной инфекции Klebsiella . Другие авторы Chilamban et al. (2004)также показали, что внутривенная инокуляция была быстрее, чем внутримаммарная, и тогда они изучали эффективность специфического литического фага против S. aureus на мышиной модели.

Однако трудно сделать вывод, какой способ введения является наиболее эффективным. Эффективность лечения зависит от различных факторов: концентрации патогенных бактерий в месте заражения, подготовки фага и применяемой дозы, состава и структуры среды и условий окружающей среды ...

специфичность
Фаги специфически заражают виды бактерий-хозяев. Эта специфичность может ограничивать эффективность использования фага. Чтобы гарантировать, что бактерии могут быть лизированы используемым фагом, бактериальный штамм, выделенный из места заражения, будет проверен на его чувствительность к вводимому фагу. Важно также проверить, является ли фаг сильно литическим или нет. Однако поливалентные фаги, которые могут заразить несколько штаммов бактерий одного и того же вида, существуют. Использование поливалентного фага позволяет увеличить спектр активности фагов. Поливалентный фаг может быть заменен коктейлем из фагов. Вкратце, фаг по своей специфичности может инфицировать только бактерии-мишени, не влияя на чужеродную бактериальную флору, но специфичность также может быть неэффективной, если целевые бактерии не лизируются введенными фагами.

- Изоляция бактерий от места заражения и проверка чувствительности этих бактерий к панели бактериофагов.
- Отбор поливалентных бактериофагов с широкой перекрестной деформацией литической активности.
- Разработка коктейля из фагов, который может увеличить спектр активности фагов против всех или большинства штаммов в пределах данного вида бактериального патогена.
Устойчивость к фагам
Как и в случае антибиотиков, бактерии могут развить устойчивость к фагу, что может снизить эффективность лечения фагом. Первым этапом заражения бактериями фагом является адгезия фага на поверхности бактерий поверхностными белками, которые действуют как рецепторы. Если бактерия теряет рецептор фага, они становятся устойчивыми к фагу. Бактерии также могут приобретать горизонтально рестрикционно-модифицированную систему, которая расщепляет нуклеиновую кислоту инъецированного фага. Кроме того, устойчивость к фагам может быть вызвана мутацией в гене, продукт которого необходим для репликации или сборки фага. В любом случае, устойчивость к фагам не вызывает проблем при использовании фагов или терапии фагами, потому что скорость, с которой у бактерий развивается устойчивость к фагам, примерно в 10 раз ниже, чем к антибиотикам ( Carlton, 1999).). Кроме того, эту скорость также можно частично обойти, используя несколько фагов в одном препарате, так же, как при одновременном применении двух или более антибиотиков. Когда происходит сопротивление против данного фага, может быть создан новый фаг, чтобы нацелиться и уничтожить новый штамм. Некоторые протоколы по выделению фага были упомянуты в литературе ( Garcia et al., 2009 ; Moineau and Fortier, 2009 ). Отбор и скрининг нового фага происходит быстрее, чем разработка новых антибиотиков, что может занять до нескольких лет ( Sulakvelidze et al., 2001 ).

Идти к:
Заключение
Использование бактериофагов в качестве противомикробных агентов, контролирующих патогенные бактерии, появилось в качестве многообещающей новой стратегии, и кажется, что фаговая терапия может обеспечить хорошее альтернативное решение антибиотикам. Обилие фагов в окружающей среде подчеркивает их потенциальное использование для борьбы с патогенными бактериями в продуктах питания и животных. Для эффективного лечения бактериофаги должны (1) присутствовать в высоких концентрациях, (2) быть стабильными во времени и в условиях in vivo , (3) способны встречаться с бактериями без каких-либо ограничений и (4) способны размножаться. Для этого необходимо учитывать некоторые моменты:

- Используйте высокий уровень концентрации фагов
- Используйте фаг для лечения бактериальной инфекции как можно скорее
- Проверить стабильность фага в реальных условиях окружающей среды.
- защитить фаг микроинкапсулированием
- Скрининг и разработка коктейля из фагового литика, способного заражать многие штаммы бактерий.
- Использовать поливалентные бактериофаги с широкой перекрестной деформацией литической активности или разработать фаговый коктейль, чтобы лизировать большинство штаммов бактерий и ограничить развитие устойчивости к фагу.
Однако в фаготерапии могут возникнуть некоторые проблемы, такие как:

- фаги могут быть нейтрализованы антителами или другими компонентами в матрицах
- бактерии могут развиваться на нескольких участках, недоступных для фага.


Существует необходимость в разработке модели, которая приближалась бы к условиям in vivo, чтобы выяснить влияние фактора на инфекционную способность фагов перед применением in vivo

Контактная Информация


View All

Фотоальбом

View All

Отзывы

 Продолжение, 2019-01-14 14:06

By: Николай Дмитриевич

Большое спасибо за информацию. Надеюсь вы продолжите выпуск познавательных материалов.


Согласовано с Экспертами Фарм.ООО

  • Стоматологическая Клиника Он и Она

    ул. Санникова, д. 13
    Северо-Восточный Административный Округ 127566
    Москва

    Мы делимся секретами, как сохранить здоровые зубы

  • ЭЛИСА

    ул.Гагарина, 27/1
    354065
    Сочи

    Медицинский Диагностический Центр

  • Унаби, Зизифус, Ююба, Китайский Финик

    Входит в топ5 самых лекарственных растений Мира. Имеет более 28 названий известных в документах с XX вв. до н.э. Описывается в библии и других священных писаниях древности. Родина- северный Китай.

  • Апрель

    ул. Макаренко, 11
    354003
    Сочи

    Аптека рядом с домом

  • ИП Барсова Е.А.

    ул. Абрикосовая, 17
    354003
    Сочи

    Аптека у дома